Ciencia y salud

Por José Antonio Lozano Teruel

La novel PCR

PCR constituyen las iniciales de la expresión inglesa Polymerase Chain Reaction o Reacción en cadena de la polimerasa

PCR constituyen las iniciales de la expresión inglesa Polymerase Chain Reaction o Reacción en cadena de la polimerasa. Los ejemplos de utilización de esta técnica son muy variados y van desde el reconocimiento de un criminal por sus huellas genéticas presentes en un cabello o en un resto de semen hasta el análisis de contaminantes, pasando por la tecnología de los estudios genéticos. Este año, como tantas veces ha sucedido en las últimas décadas, los premios Nobel de Medicina y de Química han recaído en el campo de la Biología molecular y concretamente el de Química ha sido coparticipado por el americano Kary Mullís, quien hace un par de años escribió un desenfadado e interesante artículo en Scientific American, donde junto con aspectos de su vida íntima relataba cómo se le había ocurrido hace unos años el descubrimiento de la PCR mientras conducía su vehículo por una carretera californiana.
 
La técnica de la PCR está revolucionando la Genética y Biología molecular, posibilitando sus vertiginosos avances. En esencia es como una magnífica fotocopiadora del material genético del que produce copias exactamente iguales al original. A partir de una mínima muestra, un trozo de ADN, en cada operación la duplica, lo que posibilita, mediante operaciones repetitivas, que en poco tiempo se disponga de suficiente cantidad para su estudio o manipulación. La compañía Cetus Corp. de California realizó su desarrollo técnico y hace un par de años la compañía suiza Roche adquirió los derechos correspondientes. El impacto de la técnica es tal que, si hace 4 años más de 800 trabajos de investigación se referían a la misma, el año pasado esa cifra quedó triplicada y más de una decena de miles de laboratorios ya cuentan con ella y la PCR ha permitido abrir las puertas que llevan desde el estudio básico del ADN a sus aspectos más aplicados.
 
El proceso global consta de tres fases y comienza con la disponibilidad de una muestra original, por ejemplo, una porción de tamaño adecuado de ADN, el ADN molde o modelo, posiblemente cortado a partir de una molécula mayor por medios enzimáticos. En la primera fase tiene lugar la desnaturalización, es decir, la separación de las dos hebras complementarias del ADN, mediante calentamiento a 94° C durante un minuto. La segunda fase es la de la hibridación, para lo cual hemos de disponer de los denominados primers o cebadores específicos para las dos hebras del ADN de molde. Se trata de unos fragmentos muy pequeños sintéticos de unidades constituyentes de ADN complementarias con los extremos de las hebras del ADN original a multiplicar, lo que permite que se alineen complementariamente en un minuto a 50° C; en cinco minutos consigue mediante los nucleótidos individuales fabricar una copia complementaria sobre cada una de las hebras del ADN de partida. Con este ciclo de amplificación se consigue duplicar el material original y se puede continuar con nuevos ciclos sucesivos. Los actuales instrumentos realizan las operaciones de un modo automático y además, con marcajes químicos adecuados de los primers, se puede detectar automáticamente el producto amplificado por medio de un detector láser.
 
Como las aplicaciones de la PCR son muy variadas nos referiremos únicamente a algunas de las más significativas:
 
CLONACIÓN. Consiste en realizar la fusión de un gen o porción de ADN con un vector biológico transportador. Mediante primers o cebadores adecuados de la PCR el ADN queda dotado de lugares adhesivos hacia el vector y se amplifica y facilita su manipulación.
 
CUANTIFICACIÓN DE GENES Y DE SU EXPRESIÓN. Los genes, a base de ADN, se expresan a través de sus correspondientes ARN mensajeros, ARNm, cuyo aislamiento frecuentemente es más sencillo que el del propio gen y ello hace que a partir de esos ARNm se obtenga en el laboratorio, mediante métodos enzimáticos, su ADN complementario, ADNc, que si se utiliza como molde en la PCR permitirá la investigación del gen que interesa.
 
ANÁLISIS CLÍNICOS. El 75% de las aplicaciones de la PCR se dirigen a la detección de virus y bacterias patógenos de los que se conocen regiones características de su genoma, de su ADN, que se pueden detectar y amplificar por la técnica de la PCR. Uno de los ejemplos más divulgados es la confirmación de la detección del virus HIV causante del SIDA, para lo que se usan primers que amplifican los fragmentos de las denominadas regiones env y gag del virus, permitiendo su localización en estados tempranos o latentes de la infección en los que ello no se puede hacer mediante técnicas serológicas. Otras aplicaciones importantes son las detecciones de portadores o las antenatales de enfermedades genéticas.
 
MEDIANTE AMBIENTE. Dada la sensibilidad y especificidad alcanzables, se pueden analizar mínimos residuos de contaminantes microbiológicos en suelo, aguas (presencia de materiales fecales) y otros materiales amplificando el ADN del microorganismo contaminante.
 
VIABILIDAD GENÉTICA. EVOLUCIÓN MOLECULAR. La PCR es la técnica adecuada para conocer cómo evoluciona el ADN en las especies, así como para amplificar fragmentos de ADN a partir de restos fósiles tales como mamuts congelados de hace 40.000 años, momias egipcias, etc., prácticamente sin límites de antigüedad.
 
CAZA DE GENES. Cuando se conoce la estructura primaria o secuencia de aminoácidos de una proteína, merced al código genético, se puede deducir la estructura primaria del ADN que la codifica. Ello permite sintetizar en el laboratorio secuencias parciales de sus extremos, los primers específicos, que mediante la PCR reconocen, cazan y amplifican al gen buscado que, de este modo, se puede estudiar. Ello es especialmente útil en aspectos relacionados con enfermedades genéticas.
 
MEDICINA LEGAL. Un cabello, un pequeño residuo de semen, un resto minúsculo de sangre, analizados por PCR permiten que se pueda identificar, entre muchos sospechosos, a la persona de la que proceden. El análisis del ADN mitocondrial, que se transmite exclusivamente por vía materna, ha permitido comparar los ADN de las abuelas de mayo argentinas y sus posibles descendientes que, raptados en su infancia, no conocían su identidad, consiguiéndose así decenas de confirmaciones de parentesco. Otro ejemplo reciente llamativo, ha sido la identificación de los restos del último zar y su familia o la obtención de interesantes datos sobre el hombre de Neandhertal a partir del análisis del ADN de una mancha de sangre en el hacha con la que probablemente fracturaron un cráneo.
 
Información adicional
 
* La PCR es una técnica muy útil en el estudio de la naturaleza molecular de desórdenes genéticos específicos, como se ha demostrado en los últimos años en enfermedades tales como la distrofia muscular de Duchenne, en la que falta el gen codificador de la proteína distrofina, la fibrosis quística o la neurofibromatosis, así como en las pruebas de sexo, paternidad o identificación.
 
* La enzima Taq ADN polimerasa posee una temperatura óptima de actuación muy alta, de unos 77° C lo que facilita la síntesis de las hebras complementarias de ADN sobre las hebras originales separadas. La enzima, procedente de la bacteria termofílica Thermus aquaticus, tras ser sometida 40 minutos a 95° C de temperatura aún conserva más del 50% de su actividad.
 
*Como en cada ciclo completo de amplificación de la PCR se duplica el material genético ello significa que tras 30 ciclos el factor de amplificación obtenido es 230, es decir, unos mil millones de veces la cantidad inicial existente de ADN.